Att räkna vitt blodcellsräkning

Princip. Räkning av leukocyter under mikroskopi i ett visst antal kvadrater i räkningskammaren och beräkning av deras antal i 1 liter blod, med hänsyn tagen till utspädningen av blod och räkningskammarens volym.

Reagens: 3-5% lösning av ättiksyra, tonad för färgkärnor av leukocyter med några droppar metylenblå lösning. Lösningen har en blå färg, kan lagras under lång tid.

Förloppsförloppet. I ett torrt provrör häller man 0,4 ml ättiksyra. 0,02 ml blod samlas upp från ett finger (du kan använda antikoagulationsstabiliserat venöst blod). Torka pipettens spets, släng sedan blodet från det till botten av röret, blanda, vrid och blås blandningen av blod och reagens (pipettering). Märk röret och lämna det tills det räknas. Förvara en blandning av blod med en lösning av ättiksyra rekommenderas inte mer än 2-4 timmar.

Blodet utspätt i ett provrör med ättiksyra, blanda noggrant och fyll det med en räkningskammare. Den fyllda kammaren lämnas i ett horisontellt läge under 1 min för att lösa de vita blodkropparna. Utan att ändra kamerans horisontella position placerar de den på mikroskopets bord och vid låg förstoring (okular 10 ×, lins 8 ×) räknas de vita blodkropparna i 100 stora rutor, vilket motsvarar 1600 små.

För större noggrannhet räknas leukocyter över rutnätet i stora rutor, inte uppdelade i små rutor och ränder, från det övre vänstra hörnet av gallret. För bättre kontrast mörknar synfältet, släpper kondensorn och stänger bländaren. Cellerna placerade inuti torget och liggande på två linjer räknas för att inte räkna samma cell två gånger.

Beräkningen av antalet leukocyter utförs enligt formeln:

där X är antalet leukocyter i 1 pl blod; och - antalet leukocyter i 100 stora rutor; 20 - blodutspädning; 100 är antalet stora kvadrater; 250 är omvandlingsfaktorn per 1 μl, eftersom volymen på en stor kvadrat är 1/250 μl (torgets sida är 1/5 mm, höjden är 1/10 mm).

I praktiken, för att beräkna antalet leukocyter i 1 μl blod multipliceras deras antal i 100 stora rutor med 50 och i 1 liter multipliceras det resulterande värdet med 106.

Obs. Vid räkning av leukocyter är ett fel oundvikligt i 6-8% av fallen.

  1. Med ett stort antal normocyter i perifert blod räknas de i antalet leukocyter (både leukocyter och normocyter - kärnbildade celler). För att korrekt fastställa antalet leukocyter bör det totala antalet kärnbildade blodceller subtrahera antalet normocyter.
  2. De återstående felen liknar de som uppstår vid beräkningen av antalet röda blodkroppar i räkningskammaren.

Leukocytantal

Att samla blod i leukocytblandaren till märket 0,5. Lägg omedelbart i blodet en spädningslösning av 3% ättiksyra till markeringen 11. Blanda noggrant kapillärens innehåll och fyll på Goryaevs kammare med det. Räkning utförs i minst 100 stora rutor. Dessa är stora olinjiga linjer, som är grupperade i fyra i Goryaev-kamerans galler. Beräkna antalet leukocyter i 1 1 blod med formeln:

L = N x 4000 x 20 x 10 6

där: N är antalet leukocyter i hundra stora kvadrater; 4000 är en multiplikator som minskar volymen av en liten kvadrat till volymen 1 μl blod; 20 - Korrigering för graden av blodutspädning; 1600 - antalet leukocyter i små rutor; 10 6 - antalet mikroliter i 1 l.

Rekommendationer för registrering

Sammanfattningsvis jämföra resultaten som erhållits med normala värden.

Lab № 7.3

Bestämning av mängden hemoglobin i blodet

194.48.155.245 © studopedia.ru är inte författare till de material som publiceras. Men ger möjlighet till fri användning. Finns det upphovsrättsintrång? Skriv till oss | Kontakta oss.

Inaktivera adBlock!
och uppdatera sidan (F5)
mycket nödvändigt

Att räkna vitt blodcellsräkning

Leukocytos kan vara absolut (sann) och relativ (omfördelande).

Absolut leukocytos observeras vid akuta inflammatoriska processer, vävnadsnekros, akuta bakterieinfektioner (med undantag av tyfus, brucellos, tularemi etc.), allergiska tillstånd, maligna tumörer (med vävnadsförstöring), slutna huvudskador och blödningar i hjärnan, diabetes. uremisk koma, chock, akut blodförlust, som primär reaktion - med strålningssjukdom. En signifikant ökning av antalet leukocyter uppträder med leukemi.

Relativ (omfördelande) är en följd av mottagandet av leukocyter i blodflödet från de organ som tjänar till hennes depå. Det uppstår efter att ha ätit (mat leukocytos), heta och kalla bad, starka känslor (vegetovaskulär leukocytos), intensivt muskulärt arbete (myogen leukocytos) etc.

Leukopeni. Leukopeni anses vara en indikator på inhibering av benmärgens funktionella förmåga som ett resultat av exponering för giftiga ämnen (arsenik, bensen etc.), vissa läkemedel (sulfanilamider, kloramfenikol, butadion, immuno, cyklofosfamid, etc.), virus (influensa, viral hepatit, mässling etc.), mikrober (tyfoid, brucellos, etc.), joniserande strålning, röntgen och hypersplenism (ökad mjältfunktion).

Leukocytos och leukopeni karakteriseras sällan av en proportionell ökning (minskning) i det totala antalet leukocyter av alla typer (till exempel leukocytos med förtjockning av blodet); i de flesta fall finns en ökning (minskning) i antalet av någon celltyp, därför används termerna "neutrofili", "neutropeni", "lymfocytos", "lymfopeni", "eosinofili", "eosinopeni", "monocytos", "monocytopeni", "Basophilia".

I den kliniska utvärderingen av förändringar i antalet leukocyter är stor vikt knuten till procentandelen för enskilda former av leukocyter, det vill säga leukocytformeln.

Leukocyt blodtal av en frisk person:

Relativ mängd Absolut mängd

Basofiler............................0-1% 0-0.0650 x 10 9 / l

Eosinofiler.........................0,5-5% 0,02-0,30 x 10 9/1

Neutrofiler: - myelocyter............ 0% frånvarande

- stuck... 1-6% 0,040-0,300 x 10 9/1

- segmenterade....47-72% 2,0-5,5 x 10 9 / l

Lymfocyter.................................. 19-37% 1,2-3,0 x 10 9 / L

Monocyter.............................. 3-11% 0,09-0,6 x 10 9 / L

Leukocyträkning utförs i färgade perifera blodutstrykningar. För korrekt tolkning av resultaten av studien av leukocytformeln rekommenderas att man räknar i absoluta kvantiteter men inte i relativa sådana. De vanligaste metoderna för att måla smuts av Romanovsky-Giemsa, Pappenheim. Under nedsänkning räknas åtminstone 200 celler, och sedan erhålles procentsatsförhållandet av vissa typer av leukocyter. Analys av leukogram med hänsyn till andra blodparametrar och den kliniska bilden är en värdefull metod för undersökning, det hjälper till vid diagnos och bestämning av prognosen för sjukdomen.

De främsta orsakerna till neutrofili.

Akut bakterieinfektioner - lokaliserad och generaliserad.

Inflammation eller nekros av vävnaden.

Medicinska effekter (kortikosteroider).

De främsta orsakerna till neutropeni.

Infektioner - bakteriell (tyfus, brucellos, tularemi, paratyphoid feber) och viral (infektiös hepatit, mässling, influensa, rubella och andra).

Myelotoxiska effekter och undertryckande av granulocytopoiesis (joniserande strålning, kemiska ämnen - bensen, anilin, DDT; medicinska effekter - cytostatika och immunosuppressiva medel, vitamin B12-folsyrabristanemi, akut aleukemisk leukemi, aplastisk anemi).

Antikroppsexponering (immunförsvar) - Överkänslighet mot droger, autoimmuna sjukdomar (SLE, reumatoid artrit, kronisk lymfatisk leukemi), isoimmuna manifestationer (hemolytisk sjukdom hos nyfödda).

Omfördelning och deponering i organ - chockförhållanden, sjukdomar med splenomegali och hypersplenism.

Ärftliga former (familjen godartad kronisk neutropeni).

De främsta orsakerna till eosinofili.

Parasitiska invasioner (trichinos).

Kroniska hudskador - psoriasis, pemphigus, eksem.

Tumörer (eosinofila varianter av leukemi).

Andra sjukdomar - fibroplastisk endokardit Lefflera, skarlettfeber.

I återhämtningsfasen av infektioner och inflammatoriska sjukdomar (gynnsamt prognostiskt tecken).

Orsaker till eosinopeni (aneosinofili).

Ökad adrenokortikosteroidaktivitet i kroppen.

De främsta orsakerna till basofili:

Kronisk myeloid leukemi och erythremi.

De främsta orsakerna till monocytos.

Subakta och kroniska bakterieinfektioner.

Parasitiska infektioner - leishmaniasis, malaria.

Hemoblastos - monocytisk leukemi, lymfogranulomatos, lymfom.

Andra tillstånd är SLE, sarkoidos, reumatoid artrit, infektiös monocytos; under återhämtningsperioden från infektioner, när man lämnar agranulocytos efter splenektomi.

Minskningen av antalet monocyter är viktig främst vid bedömningen av lymfocyt-monocytförhållandet i lungtubberkulos.

De främsta orsakerna till lymfocytos.

Infektioner - akut virus (infektiös mononukleos, mässling, rubella, kycklingpox), kronisk bakteriell (tuberkulos, syfilis, brucellos), protozoal (toxoplasmos).

Hemoblastos (lymfocytisk leukemi, lymfom).

Andra sjukdomar - hypertyreos, Addisons sjukdom, vitamin B12-folsyra anemi, hypo- och aplastisk anemi.

Lymfocytopeni observeras i SLE, Hodgkins sjukdom, utbredd tuberkulos av lymfkörtlarna, i det slutliga skedet av njursvikt, akut strålningssjukdom, immunbristtillstånd, som tar glukokortikoider.

Ökningen eller minskningen av antalet vissa typer av leukocyter i blodet kan vara relativt eller absolut. Om endast andelen av en viss typ av vit blodcell förändras, sker relativ neutrofili, relativ eosinopeni etc. Ökningen eller minskningen av det absoluta innehållet av någon typ av leukocyter, det vill säga antalet dessa celler per volym blodvolym, kallas absolut neutrofili, absolut eosinopeni etc.

Att ändra formeln till vänster (ökar antalet unga former av neutrofiler) är ett tecken på inflammation eller en nekrotisk process i kroppen.

Förskjutningen av leukocytformeln till höger är karakteristisk för strålningssjuka och vitamin B12-folsyrabristanemi.

Frånvaron eller signifikant minskning av antalet typer av granulära leukocyter - granulocyter (neutrofiler, eosinofiler, basofiler) betecknas med termen agranulocytos. Beroende på förekomstmekanismen särskiljs myelotoxiska effekter (effekter av joniserande strålning, cytostatiskt intag) och immun (hapten och autoimmun agranulocytos).

Leukocytantal

Räknemetoden i kameran. Ta och spädning av blod som produceras genom rörmetoden. 0,4 ml av spädningsvätskan och 0,02 ml kapillärblod införes i röret (företrädesvis Vidalevskaya). Den resulterande utspädningen anses praktiskt taget vara 1:20. En 3-5% lösning av ättiksyra tonad med metylenblå används vanligen som ett spädningsmedel (ättiksyralysesytrocyter, metylenblå fläckar kärnorna i leukocyter). Före påfyllning av kammaren Goryaeva rör med utspädd blod skakas grundligt. Kammaren fylls på samma sätt som för räkningen av röda blodkroppar.

Leukocyter är mycket mindre än erytrocyter (1-2 per stor kvadrat), för noggrannhet görs räkningar i 100 stora kvadrater (ograderade). Beräkning: 100 stora kvadrater (1600 små) räknas en leukocyt.
Kom ihåg att volymen av en liten kvadrat är 1/4000 mm3 och blodet späds 20 gånger, antalet leukocyter i 1 μl blod beräknas: 4000 20 och dividerat med 1600 = a x 1/2. Praktiskt taget är det tillräckligt för att uppnå det faktiska innehållet av leukocyter i 1 | jl blod att dela upp i halva antalet erhållna i beräkningen och tillsätt 2 nollor. Det genomsnittliga metodfelet är ± 7%.

Mer exakt (2-3% fel) och perfekt är antalet leukocyter med hjälp av elektroniska enheter. Räkningen av leukocyter i partikelräknare utförs enligt samma princip som erytrocyter. Förblod utspättes och blandas med eventuella reagenslysande röda blodkroppar. I "Technicon" autoanalysator används en lösning av ättiksyra som sådan i "Culter" och "Celloskop" -enheterna - saponin eller sapoglobin, som tillsättes utspätt (1: 500, 1: 700) i isotonisk natriumkloridlösning (6 droppar per 20 ml utspädning).

Blod leukocyträkning utförs i färgade perifera blodutslag.
Det är bättre att räkna vid den tunnaste punkten nära smutsänden, minst 200 celler (med undantag för uttalad leukopeni) och sedan härleda procentandelen för vissa typer av vita blodkroppar. Räkning rekommenderas i samma ordning: hälften av cellerna ska räknas uppe, halv i botten av stroke utan att gå till kanten och mitt, zigzagging (3-4 synsfält längs stroke, 3-4 fält i rät vinkel mot mitten av stroke, sedan 3-4 fält till sidan parallellt med kanten, igen vinklar uppåt och så vidare till ena sidan).

Framställning av utstrykningar. Noggrant tvättat och avfettat glas (dess kant) berör en bloddroppe på injektionsstället. Smörj gör slipglas, lägg det i en vinkel på 45 ° till bilden framför droppen. Efter att ha tagit glaset till denna droppe, väntar de tills blodet sprider sig längs kanten, sedan med en snabb och enkel rörelse utför de slipglaset framåt och tar inte bort det från motivet innan det torkar ut hela droppen.

Ett riktigt smet har en gulaktig färg (tunn), når inte kanterna på glaset och slutar i ett spår (mustasch).

Färgprovningar som framställs efter preliminär fixering. Den bästa fixeringen uppnås i absolut metylenalkohol (3-5 minuter) eller i en blandning av Nikiforov med lika delar av absolut etanol och eter (30 minuter).

De huvudsakliga hematologiska färgerna innefattar metylenblå och dess derivat - azurblå I (metylen azurblå) och azurblå II (en blandning av lika delar azurblå I och metylenblå), till surt vattenlösligt gult eosin.

● Målning av Romanovsky-Giemsa. Romanovsky-Giemsa-färg (fabriksgjord) har följande sammansättning: Azur II - 3 g, vattenlöslig gul eosin - 0,8 g, metylalkohol - 250 ml och glycerin - 250 ml. Arbetsfärglösningen framställs med en hastighet av 1,5-2 droppar av den färdiga färgen per 1 ml destillerat vatten. Färgen hälls på ett smet med ett eventuellt högre skikt; färgtid - 30-35 minuter Efter denna period tvättas pannorna med vatten och torkas i luft. Med denna metod kan kärnan vara väl differentierad, men cytoplasmens neutrofila granularitet är mycket sämre, så den används ofta för att färglägga ett perifert blodsprut.

● Kombinerad maj-Grunwald-Romanovsky-Giemsa färgning enligt Pappenheim. Ett färdigt färgämne, en maj-Grunwald fixativ, som är en lösning av eosinmetylenblå i metylenalkohol, pipetteras på ett fast smear i 3 minuter. Efter 3 minuter tillsätts en lika stor mängd destillerat vatten till färgen som täcker lösningen och färgen fortsätter under ytterligare 1 minut. Därefter tvättas färgen och smeten torkas i luften. Därefter ommålas det torkade smetverket med en nyberedd vattenlösning av Romanovsky-färg under 8-15 minuter. Denna metod anses vara den bästa, speciellt för uttryckningar av murgpunkta.

En ökning av antalet leukocyter i det perifera blodet över den normala nivån kallas leukocytos, en minskning kallas leukopeni. Leukocytos (leukopeni) karakteriseras sällan av en proportionell ökning (minskning) i antalet leukocyter av alla slag, till exempel leukocytos med förtjockning av blodet. I de flesta fall finns det en ökning av antalet (minskning) av någon celltyp. Ökningen eller minskningen av antalet enskilda typer av leukocyter i blodet kan vara relativt eller absolut, beroende på det totala leukocyttalet - normalt, förhöjt eller minskat. Förändringen i antalet, förhållandet mellan enskilda former och morfologi av leukocyter beror på patogenens typ och virulens, arten, kursen och omfattningen av den patologiska processen, den individuella reaktionen hos organismen.

Leukocyter (leukocyt)

Leukocyter. Kvantitativ bestämning av leukocyter. Att räkna leukocyter med hjälp av kameran Goryaeva. Kvantitativt innehåll av leukocyter. Leukocytos.

Vita blodkroppar

Antalet leukocyter i blodet beror både på deras bildningshastighet och på deras mobilisering från benmärgen, liksom på deras utnyttjande och migrering i vävnaderna (till lesionerna), infångas av lungorna och mjälten. Dessa processer påverkas i sin tur av ett antal fysiologiska faktorer, och därför är antalet leukocyter i en frisk persons blod föremål för fluktuationer: det stiger vid slutet av dagen, under fysisk ansträngning, känslomässig stress, intag av proteinmat och plötsliga förändringar i omgivande temperatur.

Kvantitativ bestämning av leukocyter

Leukocyter räknas med hjälp av Goryaev-kameran och använder automatiska räknare.

Att räkna leukocyter med hjälp av kameran Goryaeva

Med in vitro-metoden att ta blod för att räkna leukocyter:

  • 0,4 ml av en lösning av 3-5% ättiksyra tonad med metylenblå hälles i röret. Använd en kapillärpipett för att dra 20 μl blod från en ny droppe (utspädning 20 gånger), försiktigt spräng den i ett provrör med ett reagens och skölj pipetten. Blanda väl
  • ett rent och torrt lockglas gnids på kammaren så att regnbåge ringar bildas vid kontaktpunkten;
  • Blod utspätt i ett provrör, blanda väl. Änden på en rund glasstång tar en bloddropp och tar den till kanten av kammarens polerade glas.
  • Efter fyllning av kammaren lämnas den i 1 minut i vila för sedimentering av leukocyter;
  • Leukocyter beaktas vid låg förstoring (objektiv × 8 eller × 9, okular × 10 eller × 15) med mörkret synvinkel (med nedsänkt kondensor eller smalat membran);
  • för tillfredsställande resultat räknas leukocyter i 100 stora kvadrater.

Att veta volymen av en stor kvadrat och graden av utspädning av blod, hitta antalet leukocyter i 1 μl och 1 liter blod. Stora torgets sida är 1/5 mm, området är 1/25 mm2, volymen av utrymme ovanför denna kvadrat är 1/250 mm3.

Formel för att räkna vita blodkroppar:

där B är antalet leukocyter i 100 stora kvadrater;
P - utspädningsgraden (20).

Leukocytantal

Norm: 4,0-9,0 × 10 9 / L

Ökningen av antalet leukocyter över 9,0 × 10 9 / l kallas
leukocytos, en minskning av deras antal under 4,0 × 10 9 / l - leukopeni. Men även 3,5 × 10 9 i 1 liter leukocyter för ett antal individer kan vara normen. Enligt litteraturen har sådana personer ökat immunmotstånd och de är mindre benägna att bli sjuka, vilket tycks bero på behovet av ett immunsvar att ha en reserv av leukocyter i vävnader, där det finns 50-60 gånger mer än i blodet. Självklart, hos friska individer med lågt antal vita blodkroppar i perifert blod ökar deras reserver i vävnader motsvarande. Detta fenomen förklaras av ärftlig och familjär karaktär eller genom ökad påverkan av det parasympatiska nervsystemet.

Leukopeni kan vara funktionell och organisk.
Funktionell leukopeni är associerad med dysregulering av blodbildning och observeras:

  • med vissa bakterie- och virusinfektioner (tyfusfeber, influensa, koppor, rubella, Botkins sjukdom, mässling);
  • under verkan av droger (sulfonamider, analgetika, antikonvulsiva medel, antityroid, cytostatiska och andra droger);
  • under muskelarbete, introduktion av främmande protein, nerv- och temperatureffekter, svält, hypotoniska tillstånd;
  • falskt leukocytopeni kan associeras med leukocytaggregation vid långvarig förvaring av blod vid rumstemperatur (mer än 4 timmar).

Organisk leukopeni som härrör från benmärgs aplasi och dess ersättning med fettvävnad uppträder när:

  • aplastisk anemi
  • agranulocytos;
  • leukopenisk leukemi;
  • vissa former av Hodgkins sjukdom
  • joniserande strålning;
  • hypersplenism (primär och sekundär);
  • kollagen sjukdomar.

leukocytos

Leukocytos är reaktionen hos det hematopoietiska systemet mot effekterna
exogena och endogena faktorer. Det finns fysiologisk och patologisk leukocytos.

Fysiologisk leukocytos är:

  • matsmältning - efter att ha ätit, särskilt hög proteinhalt Antalet leukocyter överskrider inte 10,0-12,0 × 10 9 / l och efter 3-4 timmar återgår det till normalt;
  • med känslomässig stress (adrenalin), svår fysisk ansträngning, kylning, överdriven solexponering (solbränna), administrering av ett antal hormoner (katekolaminer, glukokortikosteroider etc.) under andra halvan av graviditeten under menstruation och på grund av ojämn fördelning av leukocyter i blodet den vanliga.

Patologisk leukocytos är uppdelad i absoluta och relativa.

Absolut leukocytos - en ökning av antalet leukocyter i blodet upp till flera hundra tusen (100,0-600,0 × 10 9 / l och mer).

  • Oftast observerad i leukemi: vid kronisk leukemi - i 98-100% av fallen vid akut leukemi - i 50-60%. Ändring av förhållandet mellan leukocytceller i benmärg och blodpunkta tjänar som grund för diagnosen leukemi.

Relativ leukocytos observeras:

  • akuta inflammatoriska och infektiösa processer, med undantag av tyfusfeber, influensa, koppor, rubella, Botkins sjukdom, mässling. Den största leukocytosen (upp till 70,0-80,0 × 10 9 / l) observeras vid sepsis;
  • under påverkan av giftiga ämnen (insektsgift, endotoxiner), joniserande strålning (omedelbart efter bestrålning);
  • som ett resultat av verkan av kortikosteroider, adrenalin, histamin, acetylkolin och digitalispreparat;
  • med vävnadsupplösning (nekros), myokardinfarkt, trombos av perifera artärer med utveckling av gangrän, brännskador, exudativ pleurisy, perikardit, uremi, hepatisk koma;
  • signifikant blodförlust vid skador, inre, gynekologisk och annan blödning.

Ökningen av antalet leukocyter i infektionssjukdomar åtföljs i de flesta fall av en förändring av leukocytformeln till vänster

Att räkna antalet leukocyter och blodplättar

Faktorer som påverkar riktigheten av studien av vita blodkroppar

- lång lagring av blod vid rumstemperatur

Norm av innehållet av leukocyter i blodet

Ålder Antal leukocyter

- 1 dag 11,6 - 22,0

- 1 vecka 8,1.- 14,3

- 1 månad 7,6 - 12,4

- Vuxna 4,0 - 9,0

Metoder för att bestämma antalet leukocyter i blodet.

- Att räkna antalet leukocyter i räkningskammaren

- Att räkna leukocyter i hematologiska analysatorer

Bestämning av antalet leukocyter i räkningskammaren.

- Räkning av leukocyter under ett mikroskop utförs efter lysning av röda blodkroppar i 100 stora kvadrater i räkningsnätet och omberäknat för 1 liter blod baserat på volymen kvadrater och utspädning av blod. Antalet leukocyter bör göras inom 2-4 timmar efter blodinsamlingen.

- Om det finns kärnbildade röda blodkroppar i det perifera blodet lyseras de inte och räknas tillsammans med leukocyter. I det här fallet, för att bestämma det verkliga antalet leukocyter subtraheras antalet celler i den röda raden från det totala antalet räknade celler.

- Till exempel: Det totala antalet leukocyter i beräkningen i kammaren (eller analysatorn) -45x109 / l. Vid beräkningen av leukocytformeln konstaterades att 50 erythroblaster (normoblaster) är närvarande per 100 leukocyter.

Vi beräknar det sanna antalet leukocyter i blodet:

150 celler - 45 x 109/1

100 celler (leukocyter) - X

X = 100 * 45 * 10/1/150 = 30 * 10/1

Således är det sanna antalet leukocyter i blodet 30 x 109/1.

De främsta källorna till fel vid beräkningen av leukocyter i kammaren:

- Felaktigt förhållande mellan blod och ättiksyravolymer i ett provrör.

- Felaktigt beredd lösning av ättiksyra (vid en koncentration på mer än 5% kan vissa leukocyter lysa, vilket leder till en underskattning av resultatet).

- Långvarig exponering av provet vid temperaturer över 28 ° C, vilket kan accelerera lyset av leukocyter i provet och leda till en underskattning av resultatet.

- Felaktig fyllning av Goryaev-kammaren. Precis som vid beräkning av röda blodkroppar måste kameran lämnas i 1 minut för att reglera cellerna.

- Goryaev-kameran tvättades inte tillräckligt bra efter den tidigare definitionen. Leukocyter kvar i kammaren kan överskatta resultaten av analysen.

Blodplätträkningsmetoder

- i räkningskammaren

Varje grupp av metoder har fördelar och nackdelar.

- Räkningen av blodplättar i kammaren är tillräckligt noggrann, kräver inte att beräkna antalet röda blodkroppar. Å andra sidan är denna metod mer arbetskrävande, eftersom blodplättarna i den inhemska formen representeras av små och dåligt kontrasterade element. Nackdelen med metoden är blodplätträkning i de kommande timmarna efter att ha tagit blod.

- Bestämning av antalet blodplättar i blodutsläpp är betydligt sämre i dess noggrannhet mot kammarmetoden eller automatiska räknare. Fel vid räkning i blodutsläpp kan bero på smärtors dåliga kvalitet och den därmed sammanhängande ojämn fördelningen av blodplättar, felaktig bestämning av antalet röda blodkroppar. En signifikant nackdel med metoden är nödvändigheten att samtidigt räkna blodplättar och röda blodkroppar i blodet. Fördelen med det är möjligheten att studera blodplättar när som helst, oavsett tidpunkten för bloduppsamlingen.

- Metoden för att bestämma blodplättar med hjälp av en hematologianalysator låter dig exakt bestämma antalet blodplättar, deras genomsnittliga volym och volymfördelning.

Leukocytantal

Antalet leukocyter beräknas med hjälp av en automatisk räknare eller i en Goryaev-kammare. För att räkna leukocyterna i kammaren framställs en Turk vätska - en ättiksyra lösning tonad med en vattenhaltig lösning av metylenblått (0,1 ml av en 0,1% lösning av metylenblå sätts till 9 ml 10% ättiksyra). I ett provrör häll 0,4 ml flytande Türk. Skaffa exakt 0,02 ml blod, lägg försiktigt till spädningsvätskan. Förtunning av blod är 1:20. Blanda väl och låt i 4 minuter. Fyll kammaren Goryaeva, efter noggrant skaka röret med utspätt blod. Kameran lämnas i 1 min på en plan yta för sedimentering av leukocyter. Sedan räknas leukocyter vid låg förstoring av mikroskopet (lins 8, okular 10 eller 15) med ett mörkat synfält (med kondensorn sänkt eller det smala membranet). Leukocyter anses vara i 100 obeslutna stora kvadrater, vilket motsvarar 1600 små. Resultaten av att räkna celler i stora rutor sammanfatta och beräkna deras antal i 1 pl blod med hjälp av formeln:


där X är antalet leukocyter i 1 pl blod; A - antalet celler räknat i 100 stora rutor, 1600 - antalet små rutor; 20 - blodutspädning; 4000 är en multiplikator som resulterar i en volym av 1 μl blod baserat på volymen av en liten kvadrat (1/4000 μl).

Räkning av leukocytformel. Färgade perifera blodutslag undersöks. Ett nödvändigt villkor för korrekt övervägande av blodkroppens morfologiska egenskaper är ett korrekt gjort och välfärgat blodutslag. En blodsprutning bereds på torra, rena, väl avfettade glider, åldrade i en blandning av Nikiforov (etylalkohol 96 º och dietyleter 1: 1). Ta en glasdia för långa kanter, rör på ytan till en droppe blod (men inte hud) som frigörs från punkteringen, eller applicera en droppe blod med en mikropipett eller en kapillär. En glasrutschbana hålls på bordet eller i vänstra handen för smala kanter. Applicera markglaset med en smal kant i glaset med blod till vänster om droppen i en vinkel på 45 ° och tryck det åt höger tills det rör blodet. De väntar tills blodet sprider sig över hela kanten av markglaset och sedan med en snabb snabb rörelse leder den från höger till vänster tills hela droppen är uttömd. En bloddropp ska vara liten och proportionerad så att hela smeten placeras på glaset och inte når 1-1,5 cm före dess kant. En välgjord smet är tunn, har en gulaktig färg och slutar i en "kvast". Lufttorkade blodsmörjmedel placeras i specialrätter för fixering eller i vanliga glasögon fyllda med fixeringsvätska (metylalkohol, fixeringstid 3-5 minuter, etylalkohol, 30 minuter, Nikiforov-blandning, 20-30 minuter). Fasta preparat torkas i luften och färgas sedan med Romanovsky-Giemsa färgämne. Den färdiga färglösningen Romanovsky-Giemsa (azureosin) späddes 1:10 i den erforderliga volymen för färgning. Fasta utstrykningar hälls med utspädd färg, vilken hälls på smeten med ett eventuellt högre skikt. Färgningen varar beroende på lufttemperaturen i rummet från 25 till 45 minuter. Efter avslutad färg, tvätta av färgen med destillerat vatten och lägg strokar vertikalt i ett träställ för torkning. Mikroskopi av blodutsug utförs med nedsänkning vid 100 × 10 förstoring. Antalet leukocyter räknas ut längs en zigzaglinje ("Meander line"). 100-200 celler räknas med hänsyn till antalet enskilda former av leukocyter: sticka och segmenterade neutrofiler, eosinofiler, basofiler, monocyter, lymfocyter. Beräkna procentsatsen av varje celltyp.

Att räkna det absoluta antalet fagocyter och lymfocyter. Det absoluta antalet fagocyter (neutrofiler och monocyter) och lymfocyter hos högre vertebrater beräknas på basis av data om antalet leukocyter i perifert blod och leukocytformel.

Fagocytisk funktionstest

Bestämning av fagocytiskt index och fagocytiskt tal

Ett stort antal tekniker har utvecklats för att bedöma leukocyters absorption och digererande aktivitet. Alla är baserade på förmågan hos fagocyter att absorbera främmande partiklar som utgör testsystemet (en specifik typ av mikroorganism, zymosan, latex - absorptionsobjektet). Uppenbarelse utförs in vitro eller in vivo. Den allmänna bestämningsförloppet är följande: Hepariniserat eller citrerat friskt blod (eller fagocyt suspension) blandas med en lika stor mängd suspenderad daglig mikrobiell suspension (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E. coli, A. nydrophila) eller ett annat absorptionsobjekt. Blandningen blandas försiktigt och placeras i en termostat (37-40ºї för varmblodig beroende på kroppens normala temperatur, 26 ° C - för värmekärande fisk och lägre för kallkärlek). Efter 15, 30, 45, 60 och 90 minuter framställs smuts på glidbanor, torkas, fixeras med metylalkohol eller en Nikiforov-blandning och färgas enligt Romanovsky-Giemsa. De ser på utstrykningar under nedsänkning och bestämmer fagocytisk aktivitet - andelen fagocyter som deltar i fagocytos, fagocytiskt index - antalet testmikroppar fångade av en fagocytisk leukocyt, fagocytisk tal - det genomsnittliga antalet fagocytiska objekt per 1 aktiv neutrofil. Utvärdering av indikatorer vid olika tidsintervaller gör det möjligt för oss att uppskatta dynamiken i fagocytos. Normalt, efter 90 minuter, bör fagocytiskt index vara lägre än efter 45 minuter och 60 minuter, beroende på mikroorganismernas uppslutning. Vid bristande matsmältning ändras inte.

Bedömning av fagocyters funktionella aktivitet genom reduktionsreaktionen av nitro-blue tetrazol (NBT-test)

Detta test är en indikator på fagocyternas baktericidfunktion och låter dig utvärdera deras förmåga att syreberoende dödande. När denna dödmekanism aktiveras aktiveras enzymet NADPH oxidas, vilket leder till utseendet av reaktiva syrearter i fagocyten. Utsläpp av sådana ämnen i cellen kallas en explosion i syre (respiratorisk), som kan registreras med hjälp av NBT-testet. Vid formuleringen av detta test tillsätts ämnet nitrosiniumtetrazolium till fagocyterna, det absorberas av cellen och omvandlas i närvaro av reaktiva syrearter till en mörkblåfärgad substans, diformazan. Ju mer mörkblå granulat är fixerade på ytan eller inuti fagocyten, desto mer aktiva syreformer bildas, desto mer syreberoende dödande.

NBT-testet är inställt i två versioner: spontan och inducerad. Vid inrättandet av ett spontant NBT-test odlas fagocyter i närvaro av NST utan föregående aktivering av cellerna, när ett inducerat NBT-test utförs tillsätts en aktivator av fagocytreaktionen till odlingsmediet. Inställningen av NBT-testet i två varianter möjliggör beräkning av cellens funktionella reserv, vilket är skillnaden mellan antalet (intensitet) inducerade diformazan-positiva celler och antalet (intensitet) av spontana diformazan-positiva celler. Värdena för det inducerade NBT-testet karaktäriserar aktiviteten hos fagocytiska celler i närvaro av en antigenstimulans och anses vara ett kriterium för deras beredskap för fullständig fagocytos. Det spontana NBT-testet gör att man kan uppskatta graden av aktivering av syreberoende dödmekanismer hos icke-aktiverade fagocyter. Det karakteriserar graden av aktivering av intracellulära mikrobicidala system.

För att bilda ett spontant NBT-test tillsätts 0,05 ml av en 0,2% lösning av NBT i kaliumfosfatbuffert (0,1, pH 7,3) och 0,05 ml av samma buffert till 0,1 ml blod. Parallellt läggs ett prov för att ta hänsyn till det inducerade NBT-testet, i vilket i stället för 0,05 ml buffert tillsätts samma volym fagocytisk aktivator (till exempel pyrogenal vid en koncentration av 50 | ig / ml). Reaktionsblandningen termostateras i ett vattenbad vid 37 ° C (30-60 min). Täthet med medelstäthet framställs, torkas i luft och fixeras i etylalkohol eller Nikiforov-blandning (20 min), därefter målades med en vattenhaltig lösning av neutralt rött (0,1%, 1 min)

Efter reaktionen är blodutsprutningar mikroskoperade under nedsänkning (100 × lins, 10 × okular). Bland 100 celler räknas andelen aktiverade neutrofiler (DAN,%) innehållande diformazangranuler. Enligt mängden av diffformazan avsatt i cellerna utvärderas deras aktivitet i godtyckliga enheter och det neutrofila aktiveringsindexet (IAN, använda enheter) beräknas:

var är Hneg. - antalet celler som inte innehåller diformazangranuler;

H1 - antalet celler i vilka området för diformazanavlagringar är mindre än 1/3 av kärnområdets yta;

H2 - Antalet celler i vilka depormer av diformazan tar från 1/3 till hela kärnans storlek.

H3 - Antalet celler i vilka diformazanavlagringar upptar ett större område av kärnan.

Deriveringen av mobiliseringskoefficienten (KM) utförd enligt följande formel: